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解脲脲原体的三种检测技术比较研究

时间:2021-08-26作者:陶琪 李桂军
本文导读:这是一篇关于解脲脲原体的三种检测技术比较研究的文章,RNA恒温扩增实时荧光方法(Simultaneous amplification and testing,SAT)作为一种新的检测技术,检测Uu结果阳性提示活菌现症感染,能更好地指导临床诊治Uu感染,逐渐被用于临床。

  摘    要: 目的:对比分析尿素-精氨酸肉汤显色法、实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR)及RNA恒温扩增实时荧光方法(SAT)检测解脲脲原体(Uu)结果的一致性和最低检测下限。方法:采集300例疑似Uu感染患者的生殖道分泌物标本。标本同时用尿素-精氨酸肉汤显色法、FQ-PCR方法及SAT方法检测Uu。采用Kappa检验分析三种方法检测结果的一致性。阳性样本经1:20连续稀释,三种方法检测并分析最低检测下限。评估9种细菌污染对尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu结果干扰。结果:尿素-精氨酸肉汤显色法、FQ-PCR方法和SAT方法 Uu阳性检出率分别为19.33%、30.67%和33.00%。SAT方法与尿素-精氨酸肉汤显色法、SAT方法与FQ-PCR方法和FQ-PCR法与尿素-精氨酸肉汤显色法检测结果的总一致率分别为76.33%、85.67%和82.00%,检测结果的一致性分别为较弱(kappa值为0.40)、高度一致(kappa值为0.67)和中度一致(kappa值为0.53)。三种方法中SAT方法检测下限最低,敏感性最高。大肠埃希菌和肺炎克雷伯氏菌污染可引起尿素-精氨酸肉汤培养判断Uu的假阳性。结论:三种方法中SAT方法检测Uu的敏感性最高,其与FQ-PCR方法检测结果高度一致,阳性结果提示现症感染,临床应用价值更高。

  关键词 :     恒温扩增技术;荧光定量PCR:肉汤培养;解脲脲原体;

  Abstract: [Objective]To analyze 3 laboratory methods for detection of Uu by analyzing their consistencyandminimum detection threshold.[Method]300 discharge samples were collected and detectedby using urea-arginine broth culture Fluorescent quantitation PCR( FQ-PCR) and Simultaneous amplification and testing( SAT). Consistency of detection results and minimum detection threshold of three methods described above were analyzed by Kappa test and 1: 20 multiple dilution. The effect of 9 bacterial contamination on Uu result using urea-arginine broth culturewasevaluated. [Result]With urea-arginine broth color method,FQ-PCR method and SAT method,thepositive rates of Uu were19. 33%,30. 67% and 33. 00%,respectively. The consistence rate among SAT and urea-arginine broth culture,SAT and FQ-PCR,FQ-PCR and urea-arginine broth culturewere76. 33%,85. 67% and 82. 00%,respectively,which showed weak consistency( Kappa = 0. 40),highly consistency( Kappa =0. 67) andmoderately consistency( Kappa =0. 53).Among three methods,SAT showed the highest sensitivity due to minimum detection threshold. The contamination of E. coli and K. pneumonia could cause the false positive of Uu detected by using urea-arginine broth culture.[Conclusion]Among three methods,SAT showed the highestsensitivity and highly consistencewith FQ-PCR. Positive results suggested a symptomatic infection. SAT has higher clinical value than urea-arginine broth culture and FQ-PCR.

  Keyword: simultaneous amplification and testing; Fluorescent quantitation PCR; broth cultivation; ureaplasmaurealyticum;

  解脲脲原体(Ureaplasmaurealyticum,Uu)的持续感染可引起不孕不育、早产、尿道炎等多种疾病。实时荧光定量PCR方法(FQ-PCR)和尿素-精氨酸肉汤显色法是临床实验室检测Uu的常用方法。RNA恒温扩增实时荧光方法(Simultaneous amplification and testing,SAT)作为一种新的检测技术,检测Uu结果阳性提示活菌现症感染,能更好地指导临床诊治Uu感染,逐渐被用于临床[1]。尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu会出现假阳性[2],FQ-PCR检测Uu-DNA结果阳性无法判断现症感染还是既往感染[3]。我们近期临床应用发现,SAT检测Uu较之FQ-PCR方法和肉汤显色法的灵敏度相对较高。现将结果报告如下。
 

解脲脲原体的三种检测技术比较研究
 

  1、 材料与方法

  1.1、 材料

  1.1.1 、标本来源

  选择2020年4-10月间来嘉兴市妇幼保健院生殖中心就诊,疑似Uu感染不孕不育症患者300例。对采集的患者生殖道标本同时用尿素-精氨酸肉汤显色法、FQ-PCR方法及SAT方法检测Uu。

  1.1.2 、主要仪器与试剂

  ABI 7500荧光定量PCR分析仪(美国,ABI公司)。Uu-DNA检测试剂购自中山大学达安基因股份有限公司,Uu-RNA检测试剂购自上海仁度生物科技有限公司,Uu培养鉴定试剂盒购于法国梅里埃公司。其它试剂实验室自备。

  1.2 、方法

  1.2.1、 尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu

  标本接种尿素-精氨酸肉汤培养基并置37℃培养48h,观察肉汤颜色变化,由黄色变成红色或粉红色判断Uu检测阳性。

  1.2.2 、FQ-PCR方法检测Uu

  标本经12000rpm离心10 min弃上清,沉淀经1mL生理盐水洗涤,再次离心弃上清,沉淀加50μL DNA裂解液混匀,100℃水浴10min,置4℃静置30 min,12000rpm离心2 min。取上清液2μL加入配好的20μL PCR反应体系中,离心并置PCR仪进行扩增。扩增条件为93℃2 min预变性;93℃45s,55℃60s,10个循环;93℃30s,55℃45s,30个循环。分析扩增曲线呈“S”型且CT值<30判断Uu-DNA阳性。

  1.2.3、 SAT方法检测Uu

  取200μL标本与等体积保存液混匀后,加100μL核酸提取液振荡,60℃加热5min并置室温10min,置磁珠架静置5min,弃液体保留磁珠,加洗涤液1000μL与磁珠混匀后,再次置磁珠架5min,吸液体保留磁珠。重复洗涤二次后,弃液体。加40μL配好的SAT-PCR反应体系与处理好的磁珠混匀,取30μL置PCR反应管中,放置干式恒温仪上运行60℃10min,42℃5min后,加42℃预热的酶10μL并置PCR仪中42℃1min,扩增40个循环。分析扩增曲线呈“S”型判断Uu-RNA阳性。

  1.3 、统计学处理

  采用SPSS 17.0软件进行数据处理。采用行×列表资料的χ2检验进行阳性检出率的比较。利用kappa检验评价三种检测方法结果的一致性,kappa值大于0.8为一致性极强,0.6~0.8为高度一致,0.4~0.6为中度一致,0.2~0.4为一致性较弱[1]。P<0.05为差异有统计学意义。

  2、 结果

  2.1、 Uu感染阳性检出率

  300例疑似Uu感染患者经尿素-精氨酸肉汤显色法、FQ-PCR方法和SAT方法的检出阳性例数分别为58例、92例和99例,阳性检出率分别为19.33%、30.67%和33.00%。检出率差异显着(χ2=16.024,P<0.001)。

  2.2、 SAT方法与尿素-精氨酸肉汤显色法检测结果一致性比较

  对300例疑似Uu感染患者生殖道标本同时应用SAT方法和尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu,结果见表1。从表1可见,阳性检出率SAT法高于尿素-精氨酸肉汤显色法(P<0.05),且两种方法检测结果的kappa一致性检验值仅为0.40,一致性较弱,阳性一致率仅为43.43%,总一致率为76.33%。此外发现有4份尿素-精氨酸肉汤显色法检测阳性且培养基呈浑浊状的标本经SAT及FQ-PCR方法检测均为阴性,进一步细菌培养发现尿素-精氨酸肉汤中大肠埃希菌生长。说明尿素-精氨酸肉汤中混有细菌生长会引起假阳性结果。

  表1 SAT方法与尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu结果比较
表1 SAT方法与尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu结果比较

  *:McNema配对卡方检验

  2.3 、SAT方法与FQ-PCR方法检测结果一致性比较

  对300例疑似Uu感染患者生殖道标本同时应用SAT方法和FQ-PCR方法检测Uu,结果见表2。从表2可见,SAT法与FQ-PCR法阳性检出率无差异(P>0.05),且两种方法检测结果的kappa一致性检验值为0.67,检测Uu结果高度一致,阳性一致率达到74.75%,总一致率85.67%。

  表2 SAT方法与FQ-PCR方法检测Uu结果比较
表2 SAT方法与FQ-PCR方法检测Uu结果比较

  *:McNema配对卡方检验

  2.4 、FQ-PCR方法与尿素-精氨酸肉汤显色法检测结果一致性比较

  对300例疑似Uu感染患者生殖道标本同时应用FQ-PCR方法和尿素-精氨酸肉汤显色法检测Uu,结果见表3。从表3可见,FQ-PCR法阳性检出率高于尿素-精氨酸肉汤显色法(P<0.05),且两种方法检测结果的kappa一致性检验值仅为0.53,检测Uu结果中度一致,阳性一致率为52.17%,总一致率82.00%。

  表3 尿素-精氨酸肉汤显色法与FQ-PCR方法检测Uu结果比较
表3 尿素-精氨酸肉汤显色法与FQ-PCR方法检测Uu结果比较

  *:McNema配对卡方检验

  2.5 、三种方法检测Uu的最低检测下限比较

  将经三种方法检测均为阳性的标本用尿素-精氨酸肉汤培养基按1:20,1:400,1:8000……连续20倍稀释,混匀并吸取各稀释浓度标本200μL分别至尿素-精氨酸肉汤中35℃培养48h,观察各瓶肉汤培养基颜色变化并判断阴阳性后,每瓶取0.5mL分别利用FQ-PCR和SAT法检测Uu。结果发现三种方法中尿素-精氨酸肉汤法最低检测下限最高,稀释到1:206时检测即为阴性,而FQ-PCR方法SAT方法直到分别稀释到1:208和1:2010时检测才为阴性。三种方法中SAT方法的检测下限最低,敏感性也最高。即使FQ-PCR方法的敏感性也比尿素-精氨酸肉汤法高400倍,这提示我们,对经尿素-精氨酸肉汤检测结果可疑标本应利用SAT或FQ-PCR方法复检Uu,以免出现假阴性结果。结果见表4。

  表4 不同稀释度Uu阳性标本经尿素-精氨酸肉汤、SAT和FQ-PCR方法检测结果
表4 不同稀释度Uu阳性标本经尿素-精氨酸肉汤、SAT和FQ-PCR方法检测结果

  2.6、 细菌污染对尿素-精氨酸肉汤培养法检测Uu结果干扰

  取金黄色葡萄球菌(ATCC25923、ATCC29213)、铜绿假单胞菌(ATCC27853)、大肠埃希氏菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯氏菌(ATCC700603)和粪肠球菌(ATCC29212)和临床分离的白色假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌共9种细菌。调各菌液浓度1.0麦氏比浊,取200μL至尿素-精氨酸肉汤培养基中35℃培养48h,观察肉汤培养基颜色变化并判断阴阳性后,取500μL离心集菌,利用SAT、FQ-PCR法进行Uu检测。结果发现大肠埃希菌和肺炎克雷伯氏菌污染可引起尿素-精氨酸肉汤培养判断Uu的假阳性。故对于尿素-精氨酸肉汤培养基呈粉红色或红色且肉汤浑浊的Uu检测结果,应利用SAT或FQ-PCR方法复检Uu,以免出现假阳性结果。

  3、 讨论

  Uu的临床诊断依据为患者有泌尿生殖道感染相关症状,同时实验室检测Uu阳性可诊断Uu感染[2]。尿素-精氨酸肉汤显色法是实验室检测Uu最常用方法,但此方法敏感性不强[4]。如本组资料300例疑似Uu感染患者生殖道标本经尿素-精氨酸肉汤显色法检测阳性率仅为19.33%,明显低于FQ-PCR方法和SAT方法的阳性检出率。此外将Uu阳性标本按1:20,1:400,1:8000……连续20倍稀释,稀释到1:206以后尿素-精氨酸肉汤显色法检测结果开始为阴性,而FQ-PCR方法SAT方法直到分别稀释到1:208和1:2010以后时检测结果才为阴性。结果说明三种方法中尿素-精氨酸肉汤法最低检测下限最高,敏感性最低,检测结果存在一定假阴性。故对经尿素-精氨酸肉汤检测结果可疑标本应利用SAT方法或FQ-PCR方法复检Uu,以免出现假阴性结果。尿素-精氨酸肉汤显色法也存在一定的假阳性[2]。如本组资料将大肠埃希氏菌、肺炎克雷伯氏菌接种到尿素-精氨酸肉汤培养基35℃培养48h,Uu检测结果呈阳性。这说明培养基中混有分解尿素或精氨酸的杂菌生长会引起假阳性结果,但此类情况尿素-精氨酸肉汤均呈浑浊状。对于尿素-精氨酸肉汤培养基呈粉红色或红色且浑浊的情况可利用SAT方法或FQ-PCR方法复检Uu,避免出现假阳性结果。

  利用FQ-PCR方法检测Uu-DNA也是实验室常用方法之一,此方法检测灵敏度较高。如本组资料FQ-PCR方法的最低检测下限比尿素-精氨酸肉汤法低400倍。但因病原体死亡后,其DNA完全降解需要一段时间,故检测Uu-DNA阳性只能说明患者近期发生了Uu感染,而无法判断检测的DNA是来自体内死亡Uu病原体未完全降解DNA还是活Uu病原体DNA,也就不能正确判断是现症感染还是既往感染,从而对指导临床Uu治疗及疗效观察作用有限。而SAT方法检测的是病原体RNA[2,5]。RNA仅存在于活病原体体内,病原体死亡RNA自动降解,故SAT方法检测Uu阳性可判断为现症感染。本组资料中18例FQ-PCR方法检测阳性而SAT方法检测阴性结果可能就是上述情况。

  本组资料通过对比SAT方法与FQ-PCR方法检测Uu结果的一致性时,虽然发现两种方法的kappa一致性检验值为0.67,检测结果高度一致,与文献报道结论一致[1],但其检测下限比FQ-PCR方法低400倍,此外有25例FQ-PCR方法检测阴性而SAT方法检测阳性,均说明SAT检测灵敏度比FQ-PCR高。总之,SAT方法敏感性强,结果阳性可提示现症感染,用此方法动态检测,能更好地指导临床Uu诊治。

  参考文献

  [1]方伟祯,蔡振华,张银霞,等.SAT技术在沙眼衣原体和解脲脲原体检测中的应用[J]中华检验医学杂志, 2018,41(5)-380-384.
  [2]张岱,刘朝晖生殖道支原体感染诊治专家共识[J]中国性科学, 2016,25(3):80-82.
  [3]童郁,邵展,戴显宁,等.RNA恒温扩增技术诊断新生儿解脲脲原体感染的价值[J]中华新生科杂志, 2017,32(5):371-373.
  [4]张欠欠,许恒立,原军婷,等荧光定量PCR检测淋球菌、沙眼衣原体和解脲脲原体结果分析[J] .中国人兽共患病杂志, 2016,32(3):312-314.
  [5]Chen Q Zheng H,Zhang QH et al.Development and evaluation of a real-time method of simultaneousamplification and testing of enterovirus 71 incorporating aRNAinternal cont
  rol system[J].Journal of Virological Mehtods ,2014, 196(1):139-144.

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