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基因工程论文(权威推荐6篇)

时间:2018-03-02 09:34作者:羽沫
本文导读:这是一篇关于基因工程论文(权威推荐6篇)的文章,基因工程药物在目前医药市场所占的比例越来越大。在基因工程药物生产的过程中, 抗生素在某些环节起到了不可或缺的作用。本文就抗生素在基因工程药物生产中的应用进行总结。
  基因工程论文一:

        题目:抗生素在基因工程药物生产中的应用

 
  摘要:基因工程药物在目前医药市场所占的比例越来越大。在基因工程药物生产的过程中, 抗生素在某些环节起到了不可或缺的作用。本文就抗生素在基因工程药物生产中的应用进行总结。
 
  关键词:抗生素; 基因工程药物; 工程细胞;
基因工程论文  配图
 
  自20世纪80年代以来, 现代生物技术的飞速发展, 特别是分子克隆、基因重组以及生物工程和细胞大规模培养等关键技术的突飞猛进, 已经有越来越多的生物技术药物进入临床应用, 成为防病、治病药物的一个重要部分。当前生物技术药物正赶超传统化学制药, 逐渐成为现代医学所依靠的重要药物来源, 是当今最活跃和发展最迅速的领域。据1998年美国药学会统计, 美国FDA已批准了56种生物技术医药产品上市, 其中绝大多数为基因工程药物。此外, 还有200多种基因工程药物正在进行临床试验, 其中至少有1/5的产品将可能在今后十年内上市[1]。
 
  基因工程药物主要是指利用重组DNA技术, 将生物体内生理活性物质的基因在细菌、酵母、动物细胞或转基因动植物中大量表达生产的新型药物。基因工程药物生产的基本流程是:将目的基因用DNA重组的方法连接在载体上, 然后将载体导入靶细胞 (微生物、哺乳动物细胞或人体组织靶细胞) , 使目的基因在靶细胞中得到表达, 最后将表达的目的蛋白质提纯及做成制剂, 从而成为基因工程类药物苗。在基因工程药物研究和生产的各个环节中, 抗生素发挥了不可替代的作用。本文以基因工程药物研发和生产的流程为线索, 探讨抗生素在基因工程药物生产中的作用。
 
  1 基因工程菌的构建
 
  1.1 宿主细胞的选择和培养

 
  基因工程中基因高效表达是指外源基因在某种细胞中的转录、翻译、所有加工过程和表达活动。在外源基因表达的过程中宿主菌的选择事关重要, 根据国家药典 (2015版) 规定, 常用的宿主细胞主要由有两大类, 第一类为原核细胞 (大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等) ;第二类为真核细胞 (酵母、丝状真菌等) [2]。作为宿主, 勿庸置疑会对外源基因的表达产生一定的影响。每一个宿主细胞都像一个微观的小工厂, 按照细胞固有的程序完成“你给它们安排的生产任务”。为了解决细胞培养过程中出现的污染问题, 宿主细胞本身可以具有选择标记, 常用的方法如抗生素标记等。但需要注意的是, 为了构建工程菌株过程中的筛选过程, 要求宿主细胞与载体所携带的抗性标种类不同, 便于后期双抗培养基的配置及阳性克隆的筛选[3]。
 
  1.2 载体中抗性筛选标记
 
  载体是指在基因工程重组DNA技术中将目的基因转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。基因工程中用于选择的筛选标记一般在载体上, 在基因工程意义上来说, 它是重组DNA载体的重要标记, 合适的筛选标记基因及其相应的筛选剂是转基因成功的关键, 供重组DNA的鉴定和选择[4]。
 
  标记基因种类多种多样, 主要包括抗性基因、颜色反应基因、代谢缺陷型互补基因和一些其他具有明显性状表型有关的基因。其中抗性基因, 尤其抗生素标记基因 (如抗卡那霉素基因、抗氨苄青霉素基因、抗新霉素基因) , 因抗生素分子更小、反应更灵敏的特点是目前最普遍使用的标记基因[5]。例如以基因克隆中普遍使用的载体p BR322为例, 该载体含有两种抗生素抗性基因作为选择标记基因:氨苄青霉素抗性基因 (Amp R) 和四环素抗性基因 (Tet R) , Tet R基因内部含有限制酶等酶切位点。将外源DNA分子和载体构建为重组子, 并转化至大肠杆菌细胞后, 接种至含有氨苄青霉素的培养基。经过培养, 含有载体的大肠杆菌因具有抗氨苄青霉素的表型, 在培养基上可形成菌落, 而不含有载体的大肠杆菌则不能生长。
 
  2 基因工程细胞 (菌株) 的发酵过程
 
  目的基因经稳定转染导入受体细胞后, 需经过一系列筛选和扩增, 获得稳定、高效表达的目的蛋白的工程细胞 (菌) 株。进行工业化大规模发酵生产时, 也是外源基因高效表达目的蛋白的过程。工程细胞 (菌) 株大规模培养的基本条件和优化设计及控制中添加适当种类和浓度的抗生素对外源基因的高效表达至关重要。
 
  2.1 培养工程细胞 (菌株) 的器皿消毒
 
  细胞培养成功与否的关键之一是防止微生物的污染。这里除了操作者必须具有很强的无菌观念、严格按照无菌规程进行操作之外, 所有培养用的器材和液体都必须进行严格的消毒灭菌处理[5]。除了物理消毒法外, 常常会用到抗生素对各种培养器皿进行消毒。常用到的抗生素包括青霉素、链霉素、卡那霉素、庆大霉素等, 但各种抗生素的用量差别很大。
 
  2.2 工程细胞 (菌株) 发酵液中添加抗生素
 
  在工业化大规模发酵工程细胞的过程中, 往往会在发酵液中有目的地加入抗生素, 其原因如下:
 
  保证基因工程菌的稳定性:基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象, 质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。在提高质粒稳定性的方法中的选择压力法, 就是在培养基中加入抗生素, 它也是工程菌培养中提高质粒稳定性的常用方法[6]。含有抗药性基因的重组质粒转入宿主细胞, 基因工程菌就获得了抗药性。发酵时在培养基中加入适量的抗生素可以抑制质粒丢失菌的生长, 消除重组质粒分裂不稳定的影响, 从而提高发酵生产率。
 
  协助形成细胞壁缺陷:在培养基中加入青霉素、甘氨酸或丝裂霉素C等因子, 便可破坏或抑制细胞壁中肽聚糖的结构或其合成受到抑制, 但还不至于造成细菌死亡, 细胞壁有缺陷的细胞, 对渗透压敏感, 容易破裂, 为胞内代谢目的产物的分离纯化提供了便利条件。
 
  防止培养过程中出现其他杂菌污染:抗生素可以通过影响杂菌细胞壁合成 (青霉素类和头孢菌素类) 、影响杂菌细胞膜渗透性 (多粘菌素和短杆菌素) 、干扰蛋白质的合成 (福霉素类、氨基糖苷类、四环素类和氯霉素) 、抑制核酸的转录 (萘啶酸和二氯基吖啶) 等方式抑制杂菌的出现。需要注意的是, 在某些生产过程中即使存在杂菌污染, 也不需要添加抗生素。因为当微生物制药过程中微生物的数量的增加及代谢物的积累, 形成的环境已经不再适合其他微生物的生长, 会主动抑制杂菌。
 
  3 合理使用抗生素
 
  过度使用抗生素的危害是多方面的, 对细菌来说, 会产生耐药性, 也就是说过多的使用抗生素会使细菌对其产生抵抗力, 从而使抗生素的抗菌作用减弱或消失[7]。抗生素使用过多是否对我们所需要的药物有一定影响?对基因工程药物的合成、制备和分离是否有影响?以上问题都是未知的。除此之外, 抗生素引发的毒性反应更不可忽视, 因此, 在基因工程药物生产过程中合理利用抗生素, 规避使用抗生素带来的一些问题, 也是我们将来的研究方向。
 
  参考文献
 
  [1]郭行彦.基因工程药物的分离与纯化方法[J].国外医学:抗生素分册, 1994 (07) :261-267.
  [2]国家药典委员会.中国人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社, 2015.
  [3]匡光伟, 孙志良, 陈小军, 等.四环素类抗菌药物的降解研究[J].农业环境科学学报, 2007, 26 (05) :1744-1788.
  [4]朱保泉, 生物制药技术[M].北京:化学工业出版社, 2004:46-102.
  [5]夏焕章, 熊宗贵, 等.生物技术制药[M].高等教育出版社, 2006:140-162.
  [6]陈兆坤, 胡昌勤, 等.头抱菌素类抗生素的降解机制[J].国外医药:抗生素分册, 2004, 25 (06) :219-265.
        [7]崔浩.抗生素的细菌耐药性:酶降解和修饰[J].国外医药:药学分册, 2006, 33 (01) :34-36.





        基因工程论文二:

  题目:阿尔茨海默病基因工程模型鼠的研究现状

 
  摘要:阿尔茨海默病 (AD) 是一种与年龄相关的严重致死性神经退行性疾病, 临床上以进行性的学习、记忆、认知功能障碍为主要特征, 其病因不明且发病机制复杂。AD给整个社会带来巨大的负担, 但目前尚缺乏有效的治疗措施, 动物模型的滞后限制了其治疗药物的筛选。近年来, 随着转基因动物技术日趋成熟, 多种AD动物模型陆续出现。目前, AD基因工程模型鼠有单转基因模型、双转基因模型以及多重转基因模型。这些模型各有优缺点, 未来需要建立更为完善的AD转基因动物模型, 以更加完整地表现AD的病理特征。
 
  关键词:阿尔茨海默病; 学习记忆障碍; 基因工程鼠;
 
  阿尔茨海默病 (Alzheimer's disease, AD) 即老年性痴呆, 是一种慢性中枢神经系统退行性疾病。根据AD协会2015年的统计数据推测, 到2050年每年将新增1亿AD患者[1]。因此, AD的防治研究显得尤为重要。其病理学特征是脑内出现高密度的老年斑和神经原纤维缠结 (neurofibrillary tangles, NFTs) 。其中, 老年斑的主要神经毒性成分是β淀粉样蛋白 (amyloid-βprotein, Aβ) , 而细胞内的NFTs主要由高度磷酸化的Tau蛋白构成[2]。根据发病年龄AD可分为早发型 (发病年龄<65岁、发病比例为1%~5%) 和晚发型 (发病年龄>65岁、发病比例>95%) 。在早发型AD中, 已证明有3个基因[淀粉样前体蛋白 (amyloid precursor protein, APP) 、早老蛋白 (presenilin, PS) 1、PS2]涉及APP裂解和Aβ的产生[3]。由于转基因技术可以在活体上研究某一特定致病基因的作用, 所以转基因动物成为AD理想的动物模型。结合Pubmed数据库、中国知网和万方数据库检索转基因动物模型和AD药物筛选相关的资料, 目前常用的动物是小鼠。因此, AD基因工程小鼠模型的建立为该病治疗药物的筛选带来希望。现就AD基因工程模型鼠的研究现状及优缺点进行综述。
 
  1 APP转基因小鼠模型
 
  APP转基因小鼠模型在脑特异性启动子的控制下表达人源APP基因, 包括血小板源性生长因子β、胸腺细胞分化抗原 (thymocyte differentiation antigen, Thy) 1或Thy-1.2和朊病毒蛋白等, 导致Aβ沉积引发认知损伤及相关病变。
 
  1.1 PDAPP转基因小鼠模型
 
  PDAPP转基因小鼠由C57BL/6小鼠与DBA/2F1小鼠交配产生, 它被转入了APP基因突变体, 使脑组织内APP蛋白过度表达, Aβ沉积增多, 最终出现人类AD样病理改变。该转基因小鼠是目前研究AD的理想实验动物模型[4]。其启动子为人类血小板源性生长因子β。随着年龄的增长, PDAPP转基因小鼠表现出渐进的Aβ沉积和小胶质细胞增生, 在8~12个月龄达到高峰, 13~15个月龄时出现认知损伤;其生命过程中呈现持续的APP高表达, 胆碱能分布随年龄增加而减少, 其中青年鼠 (4~5个月龄) 表现为突触传递的改变, 老年鼠 (27~29个月龄) 表现为显着性的突触功能丢失[5]。
 
  刘薇和卢光秀[6]研究发现, PDAPP转基因小鼠进入Y迷宫探索活动明显增加, 而随机改变方向的频率明显降低。国外有实验证实, PDAPP转基因小鼠除认知障碍外, 还存在情绪行为的改变[7]。
 
  Colivelin属于一种多肽类物质, 能有效改善PDAPP转基因小鼠的记忆障碍, 是一种能对AD发挥有效治疗作用的药物[8]。另外, 中药单体对AD也能起到改善和治疗作用。丛伟红等[9]研究发现, 人参、银杏叶提取物配伍可以调节PDAPP转基因小鼠的海马乙酰胆碱水平和单胺能系统, 尤其可以明显调节胆碱能和5-羟色胺能系统。
 
  虽然PDAPP转基因小鼠模型没有出现NFTs, 但在AD患者脑组织中存在大量的NFTs;且PDAPP转基因小鼠脑内的小胶质细胞轻度激活, 而AD患者脑内的小胶质细胞被明显激活。同时, PDAPP转基因小鼠模型的补体受体CD11b呈低表达, 但AD患者的CD11b呈高表达。因此, 该模型的病理特征与AD患者不完全一致, 主要用于研究过度表达Aβ的AD模型。
 
  1.2 Tg2576转基因小鼠模型
 
  Tg2576转基因小鼠模型是由Hsiao等[10]根据家族性AD瑞典家系的发病原因———h APP695双突变在朊病毒蛋白控制下构建APPswe转入基因而成。APPswe基因由APP695异构物组成, 包括K670N/671L瑞典型突变位点。Tg2576转基因小鼠与AD患者具有很多相似性, 如APP基因的表达、淀粉样斑块的形成、神经元退变和行为学损害等。早在1996年, 学者就发现Tg2576转基因小鼠随月龄的增加, Aβ斑块增加, 在8个月龄时, 可见较小、数量少的Aβ斑块;到9个月龄时, 可观察到数量不等的斑块;12个月龄以上时, 每张切片斑块的数量均在10个以上[11]。Tg2576转基因小鼠在10个月时神经炎斑形成, 且呈增龄性加重, 同时可见突触的丢失和小胶质细胞增生[12]。
 
  李国营等[13]研究发现, 与h APPswe小鼠相比, Tg2576转基因小鼠模型行Y迷宫测试时, 4个月龄和7个月龄的表现差异无统计学意义, 但9个月龄时两者之间的差异有统计学意义, 提示9个月龄的Tg2576转基因小鼠存在空间辨别学习记忆能力受损。
 
  1.3 APP23转基因小鼠模型
 
  APP23转基因小鼠模型由转人类APP695小鼠和APPV7171小鼠交配得来。重组体采用人APP751的结构含K670N/M671L突变位点, 由Thy-1启动子控制以保证APPswe突变基因高表达[14]。APP23转基因小鼠的病理表现较多, 具有PDAPP小鼠和Tg2576小鼠的很多特征。与正常小鼠相比, APP23转基因小鼠出现了许多APP, 数量高达7倍;而Aβ的沉积随着年龄的增长而增多, 在6个月龄时就出现Aβ沉积, 24个月时在皮质和海马区大量出现, 并伴随神经炎、突触损伤及Tau蛋白的过度磷酸化等炎症反应[15]。有研究者认为, APP23转基因小鼠是一种非常适合用来研究痴呆行为、心理学体征和症状障碍的模型[16]。在3~6个月龄时, 与非转基因小鼠相比, APP23转基因小鼠出现认知功能障碍, 且表现出在Morris水迷宫穿梭路径变长。早期低剂量长疗程给予西酞普兰, 可以改善AD小鼠空间学习记忆功能障碍, 其机制可能与上调α分泌酶水平、促进APP代谢增强相关[17]。
 
  2 PS转基因小鼠模型
 
  PS基因 (PS1和PS2基因) 通过C端蛋白水解酶而作用于APP的水解, 导致Aβ增加。PS1位于第14号染色体, 到目前为止其230个基因位点中有219个突变被证明是致病的。其中, M146V、M146L、L286V和ΔE9通过激活Aβ42改变γ-分泌酶的活性。而PS2位于第1号染色体, 其39个基因位点中有16个突变被证明是致病的。因此, PS形成了γ分泌酶的活性中心[18]。PS蛋白是一种高度保守的有8个跨膜区域的蛋白, 研究表明其可能与细胞凋亡有关[19]。另有研究证明, PS基因缺失是致命的, 这可能与其改变了Notch信号通路和信号转导相关[20]。此外有研究表明, 快速轴突运输和Tau蛋白的过度磷酸化与人的PS1基因改变相关[21]。
 
  PS1的等位基因 (PS1m146vki) 引起的小鼠PSEN1基因突变包括PS1WT、PS1M146L、PS1M146V等。研究已证实, 表达突变蛋白的小鼠表现出神经元钙稳态被扰乱, 这主要通过抑制相关的蛋白质和诱导代偿变化对动物幼崽产生重大影响[22]。Na/K腺苷三磷酸酶和信号转导蛋白质可能会在神经退化发生前引起认知和记忆障碍;同时也能够激活神经元中的糖原合成酶激酶3β信号通路, 从而促进NFTs的形成。PS1具有调控发育的作用, 条件性基因敲除PS1和 (或) PS2导致认知能力衰退和前脑退化。
 
  虽然PS1M146L突变的转基因小鼠模型细胞外的Aβ31~42蛋白水平升高, 但其体内没有形成淀粉样斑块[23]。有学者发现, PS1P117L转基因小鼠额皮质中的突触后密度蛋白95表达被改变, 提示该小鼠处于类似AD最初的神经病理阶段[24]。
 
  3 Tau转基因小鼠模型
 
  3.1 人野生型的Tau转基因小鼠模型
 

  人野生型的Tau40转基因小鼠模型[25]以人Thy-1作为启动子, 用人类最长的Tau蛋白的异构体 (4R) 建立。此模型的特点是外源性人Tau蛋白分布在小鼠脑中的大多数部位, 且其磷酸化位点与在AD脑中双股螺旋细丝上的某些磷酸化位点相同, 并可以被磷酸化依赖的特异抗体识别, 但没有发现NFTs和Tau蛋白可溶性的变化。而人野生型的Tau44转基因小鼠模型表达人类最短的Tau蛋白, 故未发现NFTs[26]。但研究者发现, 人野生型的Tau44转基因小鼠模型的Tau蛋白表达量较高, 且在3、12个月龄的小鼠中发现皮质、脑干和脊髓的神经元内有Tau蛋白的包涵体, 而在18、20个月龄小鼠的皮质内出现形态类似于AD中NFTs的胞内包涵体[27]。
 
  成人脑中有6种Tau蛋白的异构体, 而上述两个Tau转基因小鼠模型只表达单一的人野生型Tau蛋白的异构体。一种同时过表达6种Tau蛋白异构体的转基因小鼠模型由Duff等[28]于2000年建立, 他们发现Tau蛋白主要分布在轴突和突触, 而不存在于细胞内, 且没有NFTs出现。但是, 此模型的缺点是不能保证所有的Tau蛋白产物均来源于人的Tau基因。而Andorfer等[29]将小鼠内源性Tau基因敲除, 也建立了一种表达人6种异构体的小鼠模型。结果发现, 3个月龄小鼠神经元内有外源性人Tau蛋白表达, 6个月龄时磷酸化Tau蛋白出现在轴突内, 9个月龄时在皮质和海马的锥形细胞中出现类似NFTs的包涵体, 13个月龄时小鼠脑中3R的Tau蛋白产物和4R的Tau蛋白产物大致相等。这些Tau蛋白的病理改变主要分布在新皮质和海马, 少量分布在脑干和脊髓。
 
  3.2 突变型Tau转基因小鼠模型
 
  Tau P301L突变小鼠模型的特点是10号外显子错义突变, 301位的脯氨酸变为亮氨酸, 这导致Tau蛋白与微管的结合能力降低, 微管解聚失去功能, 从而使聚集的Tau蛋白存在于轴突、胞体和树突内[30]。有学者在Tau P301L突变小鼠模型的脊髓、脑干和皮质5、6层检出NFTs, 电镜下Tau蛋白细丝直径约15 nm, 较老年痴呆病患者短[31]。另有研究者根据定位航行实验结果发现, 在第2~5天时, 6个月龄Tau P301L突变小鼠的逃避潜伏期较长, 9个月龄小鼠出现较长的游泳潜伏期;空间搜索实验结果显示, 6个月龄、9个月龄Tau P301L突变小鼠的平台探测频率明显降低[32]。此外, Tau P301L突变小鼠模型在水迷宫实验中逃避潜伏期明显延长, 表明空间记忆受损[32]。
 
  表达含P301S突变的3RONTau转基因鼠模型, 其脑组织和脊髓内出现了大量的NFTs, 同时脊髓内还检测到神经元细胞的丢失[33]。在表达人基因突变型Tau蛋白的转基因小鼠模型中, 磷酸化的Tau蛋白不但与正常人大脑中的一样在轴突中表达, 也与AD患者大脑中的一样在胞体和树突中表达, 而且还表现出AD神经纤维缠结病理前期变化[34]。该转基因小鼠模型成功模拟了NFTs的病理特征, 成为研究AD与Tau蛋白、双股螺旋细丝和NFTs之间关系的重要模型。
 
  Tau45-230转基因小鼠由Thy-1.2启动子控制, 采用单细胞受精的C57BL/6j小鼠胚胎的原核注射Tau45-230-GFP转基因而来[35]。该鼠的海马椎体细胞层细胞凋亡增加, 行为学测试在水迷宫和恐惧条件测试中表现异常。而含R406W突变的4R2NTau转基因鼠记忆能力和运动能力减退, 且在脑内检测到Tau蛋白的包涵体[36]。但单一的Tau转基因小鼠只能模拟AD的一种病理改变NFTs。
 
  4 双转基因小鼠模型
 
  4.1 APP/PS1双转基因小鼠模型

 
  过度表达的人类基因APP、PS1基因与家族性AD (familial AD, FAD) 、脑内Aβ沉积紧密相关, APP/PS1双转基因鼠模型表达嵌合鼠/人APP (APPswe) 和PS1进行突变, 根据PS1突变类型不同分为APPswe/PS1d E9、APPswe/PS1M146L、APPswe/PS1L166P、APPSL/PS1M146L双转基因小鼠。APP/PS1双转基因小鼠模型的启动子为血小板源性生长因子β或朊病毒蛋白。在APP/PS1双转基因小鼠脑中, Aβ42表达显着增加;且与雄性小鼠相比, 雌性小鼠的Aβ42水平明显偏高[37]。3个月龄时, APP/PS1双转基因小鼠模型出现老年斑, 但未发现神经元丢失、NFTs等其他AD病征, 因此可以作为研究Aβ42诱导神经退行性变化和老年斑形成的重要模型。
 
  虽然研究者观察到APP/PS1双转基因小鼠模型的焦虑样行为、运动行为变化差异无统计学意义, 但空间认知能力受影响[38]。陈晨等[39]发现, 行Morris水迷宫实验时, APP/PS1双转基因小鼠的逃避潜伏期明显长于正常小鼠, 表明5个月龄时APP/PS1双转基因小鼠已出现了空间学习记忆功能的损害;而免疫组织化学、刚果红染色显示, 5个月龄APP/PS1双转基因小鼠海马及皮质均出现斑块沉积。宗园媛等[40]行Morris水迷宫实验发现, APPswe/PSΔE9双转基因小鼠模型在3、6、9个月龄时其行为学结果与同月龄野生型小鼠相比差异有统计学意义, 提示APPswe/PSΔE9双转基因小鼠出现记忆学习能力缺陷。Dikranian等[41]对APP/PS1双转基因小鼠模型行辐射状六臂水迷宫行为测试发现, 与同月龄的野生鼠相比, 6、12个月龄的小鼠出现较为严重的记忆障碍。
 
  阿魏酸多奈哌齐 (强效乙酰胆碱酯酶抑制剂) 对人神经细胞氧化损伤有保护作用[42], 它可通过抑制小胶质细胞的活化和炎性细胞因子的释放来改善APP/PS1双转基因小鼠的认知功能障碍[43]。且淀粉样蛋白化学清除剂[44]———EPPS[4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinepropane-sulphonic acid]和多奈哌齐共同服用可快速改善该鼠的认知功能。而酚类氨基甲酸酯衍生物具有抗胆碱能丧失及淀粉样生成活性的作用[45]。同时, 加兰他敏可减小APP/PS1双转基因小鼠体内淀粉样蛋白负荷总面积, 减少细胞内肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达[46]。
 
  然而, APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆行为学检测存在一定问题, 其在完成学习第2天后出现严重的遗忘, 与AD患者的表现有差异, 这可能与Aβ引发的海马损伤出现遗忘类似。另外, 在水迷宫实验中学习行为能力欠佳可能与APP/PSl小鼠质量较轻、皮下脂肪较少有关, 从而影响实验结果。
 
  4.2 APPSw DI/NOS2双转基因小鼠模型

 
  APPSw DI/NOS2双转基因小鼠模型在Thy-1启动子的控制下, 表达3种[瑞典型 (K670N/M671L) 、荷兰型 (E693Q) 和爱荷华州型 (D694N) ]不同的人APP突变基因, 及编码一氧化氮合酶的NOS2基因突变。同时, 此转基因小鼠模型还具有脑实质Aβ沉积、脑血管Aβ沉积和Tau蛋白异常[47]。APPSw DI/NOS2双转基因小鼠的特点为Aβ聚集在血管上, 无法运出大脑;神经元的突触区域进行重分配, 神经元的丢失 (包括传递神经元的丢失) ;中重度脑淀粉样血管病及严重的学习和记忆能力障碍[48]。且学者发现, 3个月龄小鼠在海马区出现脑淀粉样血管病理变化, 并伴有胶质细胞增生[49]。随着年龄增长, APPSw DI/NOS2双转基因小鼠在海马齿状回、丘脑、皮质等区域出现Aβ沉积, 在水迷宫实验中出现早期的空间和学习记忆障碍。在12个月龄时, APPSw DI/NOS2双转基因小鼠被发现有广泛的淀粉样蛋白沉积、过度磷酸化的Tau蛋白及神经元缺失[50]。而18~20个月龄时, 其出现集体筑巢行为受损, 早期社交行为出现改变[51]。
 
  4.3 Prnp-APP/APPswe双转基因小鼠模型 (CRND8转基因小鼠模型)
 
  通过仓鼠软病毒蛋白激动剂的调控, CRND8转基因小鼠模型在2~3个月龄时即表达与人类APP695同源 (KM670/671NL+v717f) 的双突变产物。CRND8转基因小鼠2个月龄时, Aβ40和Aβ42水平升高, 但无斑块沉积。大约从9周龄其开始出现斑块沉积, 4个月龄后显示多发斑块沉积[52]。虽然老年CRND8转基因小鼠没有明显的神经细胞损失, 但它表现出Aβ水平高的基础合成, 对生产Aβ42偏移, 故被认为有助于研究AD发病早期的淀粉样物沉积。且老年CRND8转基因小鼠有纹状体病理, 但年轻Tg CRND8小鼠纹状体很少发现。随着年龄的增长, 斑块变大, Tg CRND8小鼠在大约5个月龄时成熟斑块出现在海马、皮质、胼胝体;在某些情况下, 其纹状体类似于老年患者。同时, 老年Tg CRND8小鼠表现出淀粉样血管病, 且随着年龄增加, 小鼠更多斑块沉积、多发性致密核及神经改变类似于AD所见的病理变化, 故是年龄依赖性实验的重要模型[53]。
 
  与非转基因的Tg CRND8小鼠相比, 11周龄的转基因Tg CRND8小鼠显示出空间信息遭受重大损害[54]。在所有年龄段中, Tg CRND8小鼠表现出正常的短期迷宫记忆。同时经过为期3周的LY411、LY575 (γ分泌酶抑制剂) 治疗, CRND8年轻转基因小鼠皮质的Aβ40减少了69%, 且没有出现肠道不良反应[55]。
 
  4.4 APP/Tau转基因小鼠模型 (TAPP转基因小鼠模型)
 
  TAPP转基因小鼠是由Tau P301L (JNPL3) 小鼠和Tg2576小鼠杂交产生的双重转基因小鼠, 它同时具有粉样斑块和神经纤维缠结两大病理特征[56]。该模型为研究同时针对老年斑神经纤维缠结及突触丢失的药物提供了可能[31]。目前, 该模型被认为是最接近于AD病理特征的模型。在6.5个月龄时, TAPP转基因小鼠大脑出现神经元丢失, 9个月龄时出现神经纤维缠结, 同时出现淀粉样沉积[57]。该型小鼠常因其身体状况差而较难确定其行为学改变。
 
  4.5 PS/Tau转基因小鼠模型
 
  PS/Tau转基因小鼠模型是由PS1突变转基因小鼠和人最短的Tau蛋白 (3RON) 杂交而来[32]。此模型仅观察到Tau蛋白的高度磷酸化, 并未发现NFTs。其克服了单一转基因动物模型只能模拟一种病理改变的弊端, 可以更准确地模拟AD的病理改变, 同时还可以研究Tau蛋白和PS致病蛋白的相互作用, 为研究AD发病机制提供了很好的动物模型。
 
  5 多重转基因小鼠模型
 
  5.1 APP/PS1/Tau三重转基因小鼠模型

 
  三重转基因AD小鼠模型是由APPSwe、PS1、Tau P301L这3个突变基因系所建立[58]。该小鼠在6~8个月龄时, 在大脑皮质和海马区有NFTs和老年斑的形成。其中, 在6个月龄时先在皮质出现Aβ沉积, 之后海马区也发现沉积, 且学习记忆能力受损和认知障碍;而12个月龄时开始出现NFTs, 且是先海马后皮质。
 
  APP/PS1/Tau三重转基因小鼠模型既有Tau的病变, 也有Aβ的病理改变, 且行为方面还有学习记忆障碍。这为探明Tau与Aβ的关系、阐明AD的发病机制及研发靶点治疗药物提供了适宜的动物模型。它在APP/PS1双转基因小鼠基础上增加了Tau的病变;但与APP/Tau双转基因小鼠相比, 没有大脑外的身体改变。虽然有这么多的病理特征, 但仍不具有AD的全部特征。
 
  6 小结
 
  AD转基因动物模型属于病因模型, 不能完整复制出该疾病的所有特征。目前, 虽然已知的与AD有关的基因位点很有限、转基因的数量和插入位置不好控制, 基因表达不稳定, 且转基因小鼠具有繁殖能力较低、抗病能力差、价格昂贵等缺点, 但转基因动物模型的应用前景广阔。未来, 为明确AD的发病机制及其治疗药物的开发与筛选, 理想的AD动物模型的早期诊断与治疗具有重要意义。
 
  参考文献
 
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