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芒果过敏原蛋白分子的初步鉴定探究

时间:2020-11-21 16:18作者:谢涵冰
本文导读:这是一篇关于芒果过敏原蛋白分子的初步鉴定探究的文章,芒果(Mangifera indica L.)是世界第二大热带特产水果,但同时在水果过敏的病例中位居第一。芒果过敏成为影响农产品安全和人们生活质量的新问题。

  摘   要

  
  新时代人们不断追求更高品质的生活,水果作为健康必需食品的消费量也逐年递增,但水果也是食物过敏的主要过敏来源之一。芒果(Mangifera indica L.)是世界第二大热带特产水果,但同时在水果过敏的病例中位居第一。芒果过敏成为影响农产品安全和人们生活质量的新问题。目前芒果的过敏原组分还不很明确,本研究以我国最常见的过敏水果芒果为研究对象,对芒果过敏原蛋白分子做了初步鉴定,为芒果过敏诊断、脱敏治疗和品种选育提供一定参考。主要结果如下:



芒果过敏原蛋白分子的初步鉴定探究
 

  
  1.  对芒果过敏进行流行病学调查,收集芒果过敏病例80例,发现中国患者芒果过敏发生途径主要为食用(80%),其次为接触(36%)。同时,根据过敏反应出现的时间不同,芒果过敏分为具有口腔过敏综合征(OAS,口咽麻痒、唇舌肿胀)、皮疹、腹痛腹泻等症状的速发型过敏(80%)和具有丘疹、水疱等皮肤症状的迟发型过敏(20%)。
  
  2.  应用不同酸碱性的Coca’s提取液提取芒果蛋白,确定碱性环境提取效果更佳。提取‘台农一号’、‘红象牙’、‘贵妃芒’和‘凯特芒’四个品种芒果果皮与果肉总蛋白,发现各品种间蛋白质含量差异明显,“台农一号”芒果果肉蛋白含量最高为4.84mg/g,果皮蛋白含量约为果肉的60%。
  
  3.  利用芒果过敏患者血清、小鼠血清和芒果蛋白的免疫学反应和质谱分析,鉴定出分子量在25~35KDa附近过敏原蛋白,在芒果蛋白数据库查找了这一范围芒果潜在过敏原,初步确定为一个几丁质酶家族蛋白质,为芒果未命名的过敏原。应用超滤离心法、去果胶法、离子交换层析法分离和纯化出25~35KDa的芒果潜在过敏原蛋白。
  
  4.  通过大肠杆菌表达系统,成功重组芒果唯一已知完整序列的过敏原Man i 1(甘油醛3-磷酸脱氢酶),但少量芒果过敏病例的血清检测并未发现明显阳性反应。为验证Mani 1对中国患者的致敏性和下一步重组芒果潜在过敏原蛋白打下基础。
  
  关键词:   芒果;过敏原;免疫;几丁质酶。
  

  Abstract

  
  People in modern society are constantly pursuing a higher quality of life. The consumption of fruits is essential for nutritional supplements, is also increasing year by year. However fruits are also the main source of food allergies. Mangoes (Mangifera indica L.) are the world's second largest tropical specialty fruit, but are also the first in cases of fruit allergies. Mango allergy has become a new issue of safety and quality of life. At present, the exact allergen components of mango are not very clear. This study took the most common allergic fruit mango in China as the research object and identified preliminarily the mango allergen molecules, which provides a certain basis for the diagnosis, desensitization treatment and variety breeding of mango reference. The main results are as follows:
  
  1. Epidemiological investigation on mango allergy has been conducted by enrolling 80 cases of confirmed mango allergy. It is found that the main route of mango allergy in Chinese patients was ingestion (80%), followed by contact exposure (36%). At the same time, according to the time when the allergic reaction occurs, mango allergies are pided into immediate allergies (80%) with symptoms of oral allergy syndrome (oropharyngeal itching, swollen lips), eczema,abdominal pain and diarrhea, and delayed allergies with skin symptoms such as rash, papules,and blisters(20%).
  
  2. Coca’s extracts of different acids and alkalis are used to extract mango protein, and it is determined that the alkaline environment has better extraction effect. Extracted crude protein from the peel and pulp of the four varieties of ‘Tai Nong No. 1’, ‘Red Ivory’, ‘Queen Mans’ and ‘Kate Mans’was significantly different. ‘Tai Nong No. 1’ mango pulp has the highest protein content, 4.84mg / g, and the peel protein content is about 60% of the pulp.
  
  3. Using the immunological western blot with serum from mango allergic patients , mass spectrometry, and immunity reaction in mouse model , the allergen protein near 25 ~ 35KDawas identified, the mango potential allergen in this range was found, and a chitinase family protein was determined. It is a new allergen of mango. A potential allergen protein with mass of 25-35KDa was isolated and purified by ultrafiltration, centrifugation, pectin removal, and ion exchange chromatography.
  
  4. With specific cloning primers, allergen Man i 1 (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) was successfully cloned and expressed by E.coli system, but no positive reaction was found in the serum test of a small number of cases of mango allergy. Further investigation of this allergen is needed .
  
  Key words:      mango, allergen, immunity, chitinase。
  

  1、 绪  论

  
  芒果(Mangifera indica L.)属于漆树科(Anacardiaceae),芒果属(Mangifera),芒果是五种世界热带名果之一,常绿大乔木,生长于热带、亚热带地区,其果肉细嫩芳香,营养价值高,被誉为“热带水果之王”。世界上至少有90个国家生产芒果,我国是除了印度、泰国等国家外的世界芒果主产国之一,种植历史悠久。据史料记载,我国从唐朝就开始种植芒果,上世纪60年代以来开始大规模种植,通过多年的育种试验,培育了‘贵妃’、‘台农一号’、‘凯特’、‘红象牙’等一系列优良栽培品种,芒果种植业也逐渐发展成为我国热带、亚热带重要的特色支柱产业。
  
  2018年中国芒果种植面积约为27.8万公顷,收获面积15.5万公顷,总产量约为170万吨,年进口量达10万吨,出口量2万吨。芒果有多种食用形式,在旺季,它可以作为新鲜水果、奶昔和冰淇淋食用,而在淡季,它可以制作成果汁和果酱食用。
  
  近年来,我国芒果消费量逐年上升,对芒果过敏的报道越来越多。昆明地区1901例变态反应性疾病患者种食物变应原皮内试验结果表明,芒果果实过敏原皮试阳性率为42.3%[1];河南地区对298名过敏引起荨麻疹患者的调查结果表明,患者对芒果过敏发生率高达12.4%[2],在食物过敏原中位于榜首。过敏属于被低估的公共健康问题之一,食物过敏是常见的过敏性疾病,高致敏性的热带水果芒果过敏应当引起我们的重视。
  
  1.1、水果过敏反应概述。
  
  1.1.1、过敏反应机理。

  
  过敏反应是免疫系统对无害物质(大多数是蛋白质)进行攻击的过度反应,会对人体造成损害。过敏反应是内外因共同作用的。外因就是某些物质进入人体后会引起人类免疫系统的异常反应,这些物质就是过敏原,常见的过敏原有食物、粉尘、异种血清、药物等。
  
  内因是某类人群的免疫系统会对一些物质做出攻击行为,不辨敌友,免疫能力过强,属于“过敏体质”。目前医学上提出了四种过敏反应的发生途径,Ⅰ型速发型过敏反应是通过免疫球蛋白Ig E介导的,Ⅱ型是Ig G或Ig M介导的细胞毒型过敏反应,Ⅲ型免疫复合物型过敏反应的抗原常为病原微生物等生物性物质,主要抗体为Ig G,最后一种Ⅳ型迟发型过敏反应主要发挥作用的为免疫淋巴T细胞,释放淋巴因子导致组织损伤。第一种过敏类型在过敏原进入体内后发病迅速,T淋巴细胞作用的过敏类型发展缓慢、症状产生慢,通常在24至48小时后才会发病。
  
  1.1.2、水果过敏流行情况。
  
  食物过敏是一种由食物引发的不良反应,区别于食物不耐受的异常生理反应,食物过敏是摄食后机体免疫应答超出了正常范围,属于免疫反应范畴。我国约有5000万人对食物会产生过敏反应[3],水果是十大过敏食物之一。
  
  水果过敏常表现为血清免疫球蛋白Ig E介导的Ⅰ型过敏类型。人接触或食用水果后,特异性B细胞被水果中的过敏原选择性诱导抗体,特异性抗体与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面结合使人体对该水果进入致敏阶段,当该过敏原与机体再次发生接触,过敏原特异性结合致敏状态的肥大细胞、嗜碱性表面的抗体,而后这些细胞会产生组胺和前列腺素等生物活性介质并释放进入机体组织和器官,这些共同作用于机体就引起了局部或全身的过敏反应。
  
  近三十年来中国水果消费量不断增长,且中国居民对热带及亚热带和地方特色水果的需求量持续上升,水果过敏发病率与水果消费量呈正相关,水果已逐渐成为最重要的过敏食物。世界各地水果栽培及运输能力的上升导致水果过敏突破了原产地的局限,例如原产于中国的猕猴桃已成为世界性水果,猕猴桃过敏在世界范围广泛发生;中国中原地区居民对芒果等南方水果的过敏病例激增[2]。
  
  二十一世纪初,欧盟的两个框架计划EUPROTALL和EU-SAFE研究水果过敏[4],解决水果过敏问题可以改善人类生活质量。人们对水果过敏原的认知在近20年中获得了巨大进展。欧洲统计数据显示,儿童水果过敏发生率明显高于成人,约为成人的3倍,达到儿童人口总数的5%以上[5]。我国引发过敏反应的水果种类分布广泛,常见于苹果、桃等蔷薇科水果以及菠萝、芒果、荔枝等热带水果,新兴的亚热带水果杨梅由于近年来逐步推广也出现病例报道[6]。
  
  1.1.3、过敏原鉴定方法。
  
  能使人体免疫系统产生不耐受且诱发人体过敏反应的物质称为过敏原(allergen),目前蛋白质是水果过敏原的主要成分,也是研究的重点。过敏原的鉴定方法首先是将过敏原蛋白从致敏材料中提取出来,再剔除无关杂蛋白,应用蛋白质组学方法对过敏原蛋白进行分离和纯化,得到单一的蛋白质成分后进行SDS-PAGE电泳测定分子量大小,再使用免疫学方法利用患者血清鉴定该蛋白的致敏性。确定蛋白质的免疫活性后可以进行质谱分析进一步确定其分子量,s Ig E结合位点、结构特点和理化性质也都是过敏原鉴定的组成部分[7]。而近10年,基因测序和克隆的应用发展使得过敏原组分的鉴定更为全面,丰富了水果过敏原数据库的内容。
  
  水果过敏原的命名由国际免疫学会(IUIS)下属专业委员会制定规则和审核。过敏原名称四个英文字母和一个阿拉伯数字组成,四个字母分别是过敏原拉丁名属名的前三个字母和种名的第一个字母,中间用空格连接,空格后再接阿拉伯数字,阿拉伯数字代表的是该过敏原被发现的时间先后顺序。例如菠萝的主要过敏原Ana c 1,命名就是由菠萝Ananascomosus的拉丁属名而来的。同工型(isoallergen)过敏原和同种型(isoform)或变型(variant)过敏原都是用同一个学名,不同的是阿拉伯数字有不同的标号形式。
  

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  1.2、热带水果过敏的流行病学调查和过敏症状.
  1.2.1、 热带水果的流行病学调查
  1.2.2、 热带水果过敏症状
  1.2.3 、芒果过敏症状分型.
  1.3、热带水果过敏原研究进展
  1.4、芒果过敏的交叉反应现象.
  1.5、芒果基因组、转录组、蛋白组研究现状.
  1.6、芒果过敏原分子研究现状.
  1.7、研究意义
  1.8、研究内容和技术路线.
  
  2、芒果过敏病例收集与分析.
  
  2.1、 过敏病例收集方法.
  2.2、芒果过敏病例分析.
  2.3、 芒果过敏患者特异性抗体检测.
  
  3、芒果过敏原免疫学鉴定和分离纯
  
  3.1、材料与方.
  3.1.1、 试验材料.
  3.1.2、 试验仪器与试剂配制.
  3.1.3、 不同酸碱性提取液对芒果蛋白提取的影响.
  3.1.4、不同芒果品种果肉、果皮蛋白粗提液制备
  3.1.5、 离子交换层析柱分离芒果过敏蛋
  3.1.6 、去果胶超滤管纯化芒果过敏蛋
  3.1.7 、芒果果实蛋白免疫小鼠,单克隆抗体制
  3.1.8 、酶联免疫吸附法测定芒果过敏患者IgE.
  3.1.9 、芒果蛋白提取物免疫印迹鉴定
  3.2、结果与.析.
  3.2.1 、不同酸碱性提取液对芒果蛋白提取的影响.
  3.2.2、不同芒果品种果肉蛋白、果皮蛋白粗提液制备.
  3.2.3、 离子交换层析柱分离芒果过敏蛋白.
  3.2.4、 去果胶超滤管纯化芒果过敏蛋白.
  3.2.5、 芒果果实蛋白免疫小鼠,单克隆抗体制备
  3.2.6、 酶联免疫吸附法测定芒果过敏患者E.
  3.2.7、芒果蛋白提取物免疫印迹鉴定
  3.3 、25- -35kDa蛋白质谱鉴定.
  3.3.1、 鉴定方法
  3.3.2、鉴定结果
  3.3.3 、蛋白筛选.
  
  4、芒果过敏原的重组表达(大肠杆菌系统)
  
  4.1、芒果主要过敏原Man i 1的克隆与表达载体构建.
  4.2、芒果Man i 1的表达纯化.
  4.3、重组Mani1的检测
  4.4、讨论.

  5、  小  结

 
  本文对芒果这一世界性高致敏性水果的过敏原分子进行了初步的研究鉴定。收集了80例中国芒果过敏病例,对中国病例的过敏发生途径、症状等进行了统计与比较。应用不同酸碱性的Coca’s提取液提取芒果蛋白,确定碱性提取液提取芒果蛋白效果更佳。提取四个品种芒果果皮与果肉蛋白,比较了芒果品种间蛋白浓度差异。应用超滤离心法、去果胶法、离子交换层析法分离和纯化芒果过敏原蛋白。利用芒果过敏患者血清、小鼠血清和芒果蛋白的免疫学反应,发现分子量在25-35KDa范围内有一个潜在的致敏蛋白,通过质谱鉴定结合已有的研究结果,我们认为该蛋白属于几丁质酶蛋白家族。利用生物技术重组表达了芒果已报道过敏原Man i 1,为芒果几丁质酶潜在过敏原的重组表达提供基础,将潜在过敏原重组表达鉴定免疫活性后即可确定为芒果过敏原蛋白。

  目前,国内外对芒果过敏原种类、结构、性质、具体过敏机制等尚不清楚,而且国内临床上还没有用于芒果过敏体内外检测的标准产品。随着芒果消费量的增长,芒果过敏的患者也会日益增加,因此继续深入开展芒果过敏原的基础研究对于芒果过敏的诊断与治疗、低敏芒果品种的选育具有重要价值。

  由于时间和实验条件的限制,本研究尚未鉴定出新的芒果过敏原分子,今后可继续开展鉴定工作,建议如下:

  1、  将中国常见芒果品种‘台农一号’、‘贵妃芒’、‘凯特芒’提取物作为混合试剂,与目前商用检测试剂比较对于中国患者的过敏诊断的准确性。

  2、  本文中尝试用芒果蛋白纯化产物与小鼠免疫制备单抗,由于过敏原浓度太低未成功,可将纯化蛋白的浓度提高后再次尝试,或将来用于针对高丰度的过敏原的抗体制备。

  3、  对于已找出的几丁质酶潜在芒果过敏原,可使用生物学方法将其重组表达,检测其免疫学活性,确定为芒果的过敏原。

  4、  可收集更多中国芒果过敏患者血清,按地域、过敏类型、症状等区分,完善中国芒果过敏的情况调查。

  5、  应用重组出来的Man i 1研究该过敏原在中国患者中的致敏率,并对其理化性质和结构特征进行更深入的研究。

  一种水果中由几种过敏原分子,不同过敏个体所反应的主要过敏原不同。芒果果实中所含过敏原含量可能很低,病人血清所检测的特异性Ig E抗体水平也很低,因此给分子鉴定工作带来很多困难,所以一直没有一个准确的定论。本研究的流行病学调查及对25-35KDa过敏蛋白(几丁质酶Ⅰ)的鉴定,一定程度上会为接下来的芒果过敏研究提供参考价值。

  参考文献.

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